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泉源:UC欧博娱乐网2015-12-13 21:56

择要:

痛苦悲伤与瘙痒是躯体对内源性或外源性安慰发生的两种差别的躯体觉得,固然二者之间的信号转导以及神经环路依然没有明白的定论,但痛苦悲伤克制瘙痒,痛苦悲伤的缓解能够惹起瘙痒的观念已

  痛苦悲伤与瘙痒是躯体对内源性或外源性安慰发生的两种差别的躯体觉得,固然二者之间的信号转导以及神经环路依然没有明白的定论,但痛苦悲伤克制瘙痒,痛苦悲伤的缓解能够惹起瘙痒的观念已被普遍承受[1].现临床上普遍运用的组卵白去乙酰化酶( histone deacetylase,HDAC) 克制剂,可经过增加HDAC 的表达克制组卵白的去乙酰化发扬内源性镇痛作用[2].本课题组的后期研讨( 待宣布) 表现非特异性 HDAC 克制剂丙戊酸钠( sodium valproate,VPA) 克制脊髓程度 HDAC2 的表达,虽可明显缓解神经毁伤惹起的痛觉过敏,但同时会惹起猛烈的瘙痒举动学体现。该研讨基于痛苦悲伤与瘙痒之间的干系,讨论 VPA 能否也经过 HDAC2 调控脊髓程度瘙痒觉得,进而到场脊髓程度痛苦悲伤 - 瘙痒的配合调理,以期为临床公道用药提供有代价的指点意见。

  1 资料与办法

  1. 1 实行植物 成年 SPF 级昆明种小鼠,雄性,重20 ~ 25 g,由安徽医科大学实行植物中央提供。植物豢养于( 24 ±1) ℃和 12 h 光照/12 h 暗中的昼夜节律,自在摄食摄水。

  1. 2 试剂与次要仪器 注射用 VPA[赛诺菲( 杭州) 制药无限公司,批号: A2270/2CA45]; 水合氯醛、生理盐水 ( 上海制药厂) ; 氯喹( 美国 Sigma-Aldrich 公司) ; 反转录 PCR( RT-PCR) 试剂盒( 美国Invitrogen 公司) ; Electron Von Frey ( 美 国 IITC 公司) ; 视频记载仪( 日本 Olympus 公司) ; 罗氏 LightCycler 480 荧光定量 PCR 仪( 瑞士 Roche 公司) .

  1. 3 办法

  1. 3. 1 实行分组 实行一: 将昆明种雄性小鼠 48只随机分为 6 组: 精神病感性痛苦悲伤组( SNI 组) 、假手术组( Sham 组) 、瘙痒组( CQ 组) 、瘙痒溶媒组( NS组) 、痛苦悲伤瘙痒组( SQ 组) 及空缺比较组( CON 组) ;CON、SNI、Sham、SQ 组在术前 1 d、术后 1、3、5、7、9、10 d 测 定 左 后 足 机 械 缩 足 阈 值 ( mechanical with-drawal threshold,MWT) ,CON、CQ、NS、SQ 组辨别注射氯喹或生理盐水后察看小鼠舔舐右后足的工夫。实行二: 昆明种雄性小鼠 16 只随机分为 SQ-V 组和SQ-N 组。SNI 模子辨别于术后 5、6、7、8、9 d 早晚 8时注射 VPA( SQ-V 组) 及 VPA 溶媒生理盐水( SQ-N组) 2 次后测定痛苦悲伤举动学,于术后第 10 天测定MWT 后注射氯喹,察看瘙痒举动学体现。

  1. 3. 2 树立 SNI 植物模子[3]成年昆明种小鼠经10% 的水合氯醛麻醉后,切开左后肢正面皮肤,钝性别离股二头肌,表露坐骨神经及其 3 个分支( 胫神经、腓总神经和腓肠神经) ,辨别双重结扎胫神经和腓总神经,在双重结扎地方堵截,并辨别去除末了2 ~ 4 mm的神经干,术中防止间接打仗或许牵拉腓肠神经,坚持其完好性。术后分层缝合伤口,抗生素抗炎处置。Sham 组则只表露坐骨神经及其分支而不堵截。其他处置方法同手术组。

  1. 3. 3 鞘内注射的操纵办法[2]左掌压住鼠身,拇中二指按压骼骨两侧牢固,食指按在双侧尸骨前缘连线正中点皮肤上( 可触知 L5 棘突) 指示进针位点,右手持 10 μl 微量进样器与脊柱上方约成 20°角于 L5-L6 间隙进针,针尖进入一侧棘突、横突间构造后减 10°角左右迟缓推进,以鼠尾呈现忽然侧向运运为乐成标记( 能够系触及相应活动神经所致) ,按 5 mg/kg[4]剂量注射容积 5 μl VPA 或 VPA溶媒生理盐水,工夫约 5 s,然后迟缓拔出。留意进针深度约 4 mm,针头斜面向下,针尖触及椎骨有抵御感。  

  1. 3. 4 MWT 的测定[5]用 Electron Von Fery 测定小鼠的 MWT.将小鼠置于通明的无机玻璃箱中,底为 0. 5 cm ×0. 5 cm 孔径的铁蒺藜,待小鼠在无机玻璃箱中顺应 30 min 后,Electron Von Frey Rigid tip 垂直准确安顿在测定架上,空载条件下调零。安慰小鼠左侧足底,即时读数至抬腿或自动缩足,察看最大折力数据( 用 g 表现) ,以此作为机器安慰痛苦悲伤敏感目标之一。每组植物每个工夫点延续测 5 次取均匀值。察看并记载各组间及组内的 MWT 差别。

  1. 3. 5 舔足工夫[6]的检测 运用视频记载仪记载小鼠的舔足工夫,即小鼠用舌头舔舐右后肢踝枢纽关头以下部位的总工夫( 用 s 表现) .将小鼠先安排于无机玻璃箱中顺应 30 min,随后在小鼠右侧足底皮内注射 200 μg/10 μl 氯喹或 10 μl 氯喹溶媒,立刻放回玻璃箱中,并翻开视频记载仪记载注射后30 min内的舔足工夫,记载时期实行操纵职员分开实行操纵间。实行完毕后,回放视频盘算小鼠舔足工夫。

  1. 3. 6 RT-PCR 法检测 取各组小鼠脊髓 L4 - L6部位,液氮研磨,TRIzol 提取总 RNA 后 M-MLV 逆转录酶分解 cDNA.接纳 Light Cycler 480 SYBR GreenI Master 试剂检测小鼠脊髓 L4 - L6 部位 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8 基因的绝对表达量,实行独立反复 3 次。

  1. 4 统计学处置 接纳 Graph PAD Prism 5. 0 软件对实行数据停止统计剖析,并天生统计图表。计量材料以珋x ± s 表 示。多 组 比拟 采 用 One-Way ANO-VA,两两比拟接纳 Student' s t 查验,机器缩足阈值接纳 Two-Way ANOVA( 工夫为组内要素,处置为组间要素) 剖析,RT-PCR 后果接纳秩和查验停止比拟。

  2 后果

  2. 1 SNI 对痛苦悲伤举动学的影响 SNI 小鼠术后 1 d起 MWT 较 CON 组 小 鼠 MWT 明 显 降 低 ( F =109. 56,P < 0. 05) ,至第 5 天后仍处于较低程度,见图 1.

  2. 2 正常及 SNI 小鼠对氯喹或 NS 的反响 CQ 组小鼠舔足工夫较 NS 组舔足工夫明显延伸,SQ 组舔足工夫分明低于 CQ 组( F = 205. 64,P < 0. 05) .SQ-V 组舔足工夫明显高于 SQ-N 组( F = 209. 58,P< 0. 05) ,见图 2.

  2. 3 VPA 关于 SNI 小鼠痛苦悲伤 - 瘙痒举动的影响延续5 d 鞘内注射 VPA 可以明显缓解 SNI 惹起的MWT 降落( F = 110. 78,P < 0. 05) ,但会惹起小鼠舔足工夫的分明延伸( F =209. 78,P <0. 05) ,见图3、4.

  2. 4 HDAC2 在痛苦悲伤以及瘙痒条件下的表达 RT-PCR 后果提示 HDAC2 在精神病感性痛苦悲伤条件下表达分明上调( Z =4. 532 7,P <0. 05) ,而在瘙痒条件下,HDAC2 表达分明下调( Z =5. 074 3,P <0. 05) ,见图 5.

  3 讨论

  本课题组后期研讨( 待宣布) 仅偶尔察看到VPA 在缓解神经毁伤惹起的痛苦悲伤的同时会惹起猛烈瘙痒,该研讨在此根底上,进一步在分子程度上证明 HDAC2 也同时到场脊髓程度瘙痒觉得的调理,进而可以明白 HDAC2 到场脊髓程度痛苦悲伤 - 瘙痒的配合调理。

  SNI 模子具无机械痛敏发生早、集体差别性小、继续工夫长,术后可呈现明显的机器痛觉非常,保存腓肠神经、不影响小鼠一样平常运动等长处,便于准确权衡镇痛药物惹起的精神病感性痛苦悲伤的举动学表型变革。瘙痒模子首创性的树立在与痛苦悲伤模子相反的脊髓节段,增加了传统的颈背部注射氯喹诱导瘙痒模子[1]的稠浊要素,可以更好的表明相反节段脊神经的交互支配作用。

  HDAC 分为 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4 大 类,I 类 包 括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8; Ⅱ 类 包 括HDAC4、 HDAC5、 HDAC6、 HDAC7、 HDAC9、HDAC10; Ⅲ类包罗 Sirt1 ~ Sirt7; Ⅳ类包罗 HDAC11.Liang et al[7]曾经证明 HDAC2 表达的上调到场脊髓程度痛觉过敏的构成。RT-PCR 实行中,本课题组重点存眷Ⅰ类 HDAC,选取Ⅰ类 HDAC 停止 RT-PCR实行,研讨表现Ⅰ类 HDAC 中仅 HDAC2 在痛苦悲伤模子中表达明显上调,在瘙痒模子中表达明显下调,证明了课题组的后期揣测。

  Liu et al[8]最早证明瘙痒的发作与脊髓程度的μ 阿片受体( μ opioid receptor,MOR) 有关,并同时发明了与瘙痒相干的特异性受体胃泌素受体开释肽( GRPR) .深化研讨后表现 MOR 存在差别的受体亚型,并发明痛苦悲伤的调理与 MOR1 亚型有关,瘙痒与 MOR1D 亚型有关,MOR1D 经过与 GRPR 构成异二聚体而惹起激烈的瘙痒觉得。

  阿片受体是与痛觉过敏相干的经典受体,笔者揣测,脊髓程度 HDAC2 的差别性表达可惹起脊髓程度差别亚型阿片受体的差别性表达,即 MOR1 表达下调惹起痛苦悲伤的加重; MOR1D 表达上调,使得MOR1D-GRPR 异二聚体增多进而诱发瘙痒觉得的发生,但确切机制另有待进一步研讨。

  综上所述,经过外源性运用非特异性 HDAC 克制剂 VPA 干涉 SNI 惹起的精神病感性痛苦悲伤,表现VPA 在缓解 神 经 病 理 性 痛苦悲伤 时 会 惹起 瘙痒,提示HDAC2 到场脊髓程度痛苦悲伤 - 瘙痒的配合调理,但细致机制有待进一步研讨。

  参考文献

  [1] Liu Q,Tang Z,Surdenikova L,et al. Sensory neuron-specificGPCR Mrgprs are itch receptors mediating chloroquine-inducedpruritus[J]. Cell,2009,139( 7) : 1353 - 65.

  [2] Denk F,Huang W,Slidders B,et al. HDAC inhibitors attenuatethe development of hypersensitivity in models of neuropathic pain[J]. Pain,2013,154( 9) : 1668 -79.

  [3] Decosterd I,Woolf C J. Spared nerve injury: an animal model ofpersistent peripheral neuropathic pain[J]. Pain,2000,87 ( 2 ) : 149 - 58.

  [4] Hylden J L,Wilcox G L. Intrachecal morphine in mice: a newtechnique[J]. Eur J Pharmacol,1980,67( 2 - 3) : 313 - 6.

  [5] 汤黎黎,陈家骅,鲁显福,等。 脊髓程度 TRPM8 激活到场痛苦悲伤- 瘙痒共病的研讨[J]. 安徽医科大学学 报。 2014,49 ( 11 ) :1562 - 5.

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